Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via email.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 16Autori Liu X, Gao J, Sun Y, Zhang F, Guo W, Zhang SPubblicato il 29 marzo 2022 Volume 2022:16 Pagine 863—871DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S354205Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditor che ha approvato la pubblicazione: Dr Tin Wui WongXudong Liu,1– 3 Jie Gao,1– 3 Yaohui Sun,1– 3 Feng Zhang,1– 3 Wenzhi Guo,1– 3 Shuijun Zhang1– 3 1Dipartimento di Chirurgia Epatobiliare e Pancreatica, Il Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Zhengzhou, Zhengzhou , provincia di Henan, Repubblica popolare cinese;2Henan Research & Development International Joint Laboratory for Organ Transplantation Immunomodulation, Zhengzhou, Henan Province, People's Republic of China;3Centro nazionale di trattamento medico regionale per il trapianto di organi dell'Henan, Zhengzhou, provincia di Henan, Repubblica popolare cinese Corrispondenza: Shuijun Zhang, Dipartimento di chirurgia epatobiliare e pancreatica, Primo ospedale affiliato dell'Università di Zhengzhou, n. 1, East Jian She Road, Zhengzhou, 450052, Provincia di Henan, Repubblica popolare cinese, Tel/Fax +8637166913032, Email [email protected] Scopo: Il carcinoma epatocellulare (HCC), ha un tasso di mortalità molto elevato ed è il tipo più comune di cancro al fegato.Il clotrimazolo, un farmaco antimicotico tradizionale, ha ottenuto una notevole attenzione come strategia terapeutica per l'HCC.Tuttavia, i suoi effetti contro la migrazione e l'invasione delle cellule HCC, nonché i meccanismi sottostanti associati rimangono poco chiari.Pertanto, in questo studio, abbiamo studiato i suoi effetti sull'HCC e abbiamo tentato di chiarire i meccanismi molecolari sottostanti.Metodi: CCK-8 è stato utilizzato per studiare l'effetto inibitorio del clotrimazolo sulla proliferazione di diversi tipi di cellule HCC e sono stati eseguiti saggi di guarigione delle ferite e transwell per studiare il suo effetto inibitorio sull'invasione e la migrazione delle cellule HCC.Inoltre, il western blotting è stato impiegato per rilevare i cambiamenti nei livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate alla transizione epiteliale mesenchimale (EMT), delle proteine ​​​​chinasi regolate extracellulari (ERK), p-ERK, p65 e p-p65.Abbiamo anche usato attivatori ERK in combinazione con clotrimazolo per trattare le linee cellulari HCC.Risultati: il clotrimazolo ha inibito l'invasione e la migrazione delle cellule HCC e, meccanicamente, ha esercitato questi effetti antitumorali tramite EMT reprimendo la fosforilazione di ERK.Conclusione: questi risultati suggeriscono che il clotrimazolo inibisce le metastasi dell'HCC reprimendo l'EMT in modo dipendente dalla defosforilazione di ERK.Parole chiave: carcinoma epatocellulare, clotrimazolo, protein chinasi extracellulari regolate, migrazione, invasione, cancroIl cancro al fegato è la terza causa di decessi per cancro e il sesto tipo di cancro più diffuso al mondo.1 In particolare, il carcinoma epatocellulare (HCC) è il tipo più comune di cancro al fegato.2 Anche se la resezione chirurgica è la prima linea di trattamento per l'HCC, la maggior parte dei pazienti con HCC viene spesso diagnosticata in uno stadio avanzato della malattia;pertanto, sono scarsi candidati per la resezione chirurgica,3,4 e le loro opzioni di trattamento sono molto limitate.5 Nonostante i recenti progressi nelle strategie diagnostiche e terapeutiche, come lo sviluppo della chemioembolizzazione arteriosa transcatetere e l'inibitore multi-chinasi, sorafenib, la sopravvivenza dell'HCC i tassi rimangono bassi a causa degli alti tassi di recidiva e metastasi.6,7 Queste limitazioni richiedono lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che offrono la possibilità di ridurre efficacemente le recidive e le metastasi di HCC al fine di prolungare la sopravvivenza globale dei pazienti con HCC.Negli ultimi anni, la nostra comprensione degli effetti antitumorali dei farmaci antimicotici è notevolmente migliorata.8-10 Prove crescenti suggeriscono che gli antimicotici, come il ketoconazolo (usato da solo o in combinazione con altri farmaci), hanno forti effetti antitumorali.11 In particolare, gli effetti antitumorali degli antimicotici sono stati originariamente scoperti nel cancro alla prostata;tuttavia, effetti simili sono stati osservati in altri tumori, inclusi i tumori della mammella, del colon e della vescica.12-15 In quanto agente antimicotico ad ampio spettro, il clotrimazolo esercita un forte effetto inibitorio contro diversi funghi, in particolare Candida albicans.16 Inoltre, ha ha attirato notevole attenzione come opzione di trattamento del cancro.17 Secondo quanto riferito, inibisce la capacità delle cellule del cancro al seno di proliferare e metastatizzare in vitro.8,15 Tuttavia, il suo effetto sull'invasione e sulla metastasi dell'HCC non è chiaro, il che implica che sono necessari studi per determinare se può essere un potenziale trattamento per l'HCC.In questo studio, dimostriamo che il clotrimazolo può inibire la migrazione e l'invasione delle cellule HCC inibendo la transizione epiteliale-mesenchimale mediata da ERK/p65 (EMT).Questa scoperta può fornire nuove idee per il trattamento dell'HCC.Anticorpi primari contro E-caderina, N-caderina e vimentina, nonché anticorpi secondari anti-coniglio e anti-topo di capra, sono stati acquistati da Proteintech Group (Wuhan, Cina).Anticorpi primari che riconoscono NF-κB-p65, fosfo-NF-κB p65 (Ser536), ERK1/2 e fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2; Thr202/Tyr204) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Danvers, MA , STATI UNITI D'AMERICA).Il clotrimazolo è stato acquistato da Mecklin (Shanghai, Cina), mentre l'honokiol è stato acquistato da MedChemExpress (Shanghai, Cina).Linee cellulari di cancro al fegato umano [HuH7, SMCC-7721 (7721), MHCC 97H (97H) e Hep3B] sono state ottenute dall'Accademia cinese delle scienze (Shanghai, Cina).Le cellule HuH7 e Hep3B sono state coltivate in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenente 100 μg/mL di penicillina/streptomicina e il 10% di siero bovino fetale (FBS).Le cellule sono state coltivate a 37°C in atmosfera umidificata al 5% di CO2.L'effetto del clotrimazolo sulla proliferazione delle cellule HCC è stato determinato utilizzando il Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Beyotime; Shanghai, Cina).In breve, le cellule HCC (1 × 103 cellule/pozzetto) sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti e trattate con diverse concentrazioni di clotrimazolo (10, 20, 30, 40, 50, 60, 80 e 100 μM) disciolte in DMSO (0,1 % v/v) o solo con DMEM (0,1% v/v DMSO) come trattamento di controllo.Dopo 24 e 48 ore, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 10 μL del reagente CCK-8 e, dopo incubazione per 1 ora a 37 °C, le misurazioni dell'assorbanza sono state eseguite a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre (Modello 3550; Bio- Rad; Hercules, CA, USA).Il rapporto di proliferazione relativo delle cellule è stato calcolato come segue: (valore di assorbanza sperimentale/valore di assorbanza di controllo) × 100%.Sono stati eseguiti almeno tre test indipendenti, ciascuno con sei pozzi.La migrazione delle cellule HCC è stata esaminata eseguendo un test di guarigione delle ferite.In breve, le cellule HCC sono state seminate in piastre da 6 pozzetti.Successivamente, una lunga ferita verticale è stata inflitta al monostrato utilizzando una punta di pipetta da 10 μL.Dopo l'induzione della ferita, le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di clotrimazolo, honokiol o solo DMEM (0,1% v/v DMSO) come trattamento di controllo per 48 ore.Dopo che le cellule hanno raggiunto la confluenza, sono state osservate al microscopio (200 ×) e il rapporto di chiusura della ferita è stato calcolato come segue: (0 h di larghezza della ferita - 48 h di larghezza della ferita)/0 h di larghezza della ferita.I saggi di transwell sono stati eseguiti utilizzando filtri transwell in policarbonato da 8 μm (Coring; Cambridge, MA, USA).In breve, Matrigel (BD Biosciences; Bedford, MA, USA) è stato sciolto durante la notte a 4 ° C.Il giorno successivo, 150 μL della soluzione di Matrigel sono stati aggiunti ai pozzetti di un lettore di piastre a 24 pozzetti.Successivamente, le piastre sono state incubate a 37 ° C per 30 minuti seguite da trattamento con clotrimazolo per 24 ore, le cellule HCC sono state aggiunte alla camera interna e il mezzo DMEM, contenente il 10% di FBS, è stato aggiunto alla camera inferiore.Questa è stata seguita da un'incubazione per 24 ore, dopo di che le cellule non invadenti sono state spazzate via, mentre le cellule invasori sono state fissate in paraformaldeide per 15 minuti, colorate con cristalvioletto per 15 minuti e contate (cinque campi selezionati casualmente) a 200 × ingrandimento al microscopio.Le proteine ​​sono state separate su un gel SDS-poliacrilammide al 12% e successivamente trasferite su membrane PVDF (Merck Millipore; Carrigtwohill, Irlanda), che sono state quindi bloccate in latte scremato a 37°C per 1 ora e successivamente incubate con diversi anticorpi primari (E- caderina, N-caderina, vimentina, NF-κB-p65, p-p65, Erk1/2 e p-Erk1/2).Nella fase successiva, le membrane sono state lavate tre volte con 0,1% di TBST e ulteriormente incubate in anticorpi secondari anti-coniglio di capra o anti-topo di capra per 2 ore.Le proteine ​​di interesse sono state quindi visualizzate utilizzando un kit di chemiluminescenza potenziato (Millipore; Billerica, MA, USA) e tramite autoradiografia.L'analisi densitometrica è stata eseguita utilizzando il software Image J (GE Healthcare; Buckinghamshire, Regno Unito).Il software SPSS v17.0 (IBM Inc., Chicago, IL, USA) è stato utilizzato per l'analisi statistica.Tutti i dati sono stati espressi come media ± deviazione standard.Le differenze tra due gruppi sono state valutate eseguendo i test t di Student, mentre l'ANOVA unidirezionale è stata eseguita per confrontare più gruppi.La significatività statistica è stata fissata a P < 0,05.Diverse linee cellulari HCC sono state trattate con diverse concentrazioni di clotrimazolo per 24 ore e 48 ore per esplorare l'effetto del farmaco sulla proliferazione delle linee cellulari.Pertanto, i test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) hanno dimostrato che il trattamento delle cellule HCC con clotrimazolo per 24 e 48 ore ha inibito la loro proliferazione in modo dose-dipendente (Figura 1).Le vitalità delle cellule 97H, 7721, Hep3B e HuH7 trattate per 48 ore erano inferiori a quelle delle loro controparti trattate per 24 ore (Figura 1A-D).Questi risultati hanno suggerito che il clotrimazolo inibisce la proliferazione delle cellule HCC.Figura 1 Il clotrimazolo inibisce la proliferazione delle cellule HCC.(A–D) La proliferazione delle linee cellulari 97H (A), 7721 (B), Hep3B (C) e HuH7 (D) con la diversa concentrazione del trattamento con clotrimazolo saggiata da CCK8.Le assorbanze sono state misurate a 24 ore e 48 ore dopo il trattamento con clotrimazolo.Figura 1 Il clotrimazolo inibisce la proliferazione delle cellule HCC.(A–D) La proliferazione delle linee cellulari 97H (A), 7721 (B), Hep3B (C) e HuH7 (D) con la diversa concentrazione del trattamento con clotrimazolo saggiata da CCK8.Le assorbanze sono state misurate a 24 ore e 48 ore dopo il trattamento con clotrimazolo.Successivamente abbiamo impiegato saggi di guarigione delle ferite per esaminare l'effetto del clotrimazolo sull'invasione delle cellule HCC (linee cellulari Hep3B e HuH7).In particolare, le cellule HCC sono state ferite, seguite da trattamento con clotrimazolo (20 μM) per 48 ore e analisi microscopica.Rispetto al gruppo di controllo, i graffi erano più ampi nelle cellule HCC dopo il trattamento con clotrimazolo (Figura 2A e B).Inoltre, la valutazione delle capacità di invasione e migrazione delle cellule HCC tramite i saggi Transwell ha mostrato che con o senza l'aggiunta di Matrigel, meno cellule HCC hanno attraversato la membrana dopo 48 ore di trattamento con clotrimazolo rispetto al gruppo di controllo (Figura 2C e D) .Questi risultati hanno dimostrato che il clotrimazolo inibisce le capacità di invasione e migrazione delle cellule HCC.Figura 2 Il clotrimazolo inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule HCC.(A e B) L'effetto del clotrimazolo (20μM) sulla migrazione delle linee cellulari HuH7 (A) e Hep3B (B) rilevate dal test di guarigione delle ferite.(C e D) L'effetto del clotrimazolo sulla migrazione e l'invasione delle linee cellulari HuH7 (C) e Hep3B (D) rilevate dal saggio transwell.I risultati della quantificazione sono espressi come media ± DS (n=3), *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo.Figura 2 Il clotrimazolo inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule HCC.(A e B) L'effetto del clotrimazolo (20μM) sulla migrazione delle linee cellulari HuH7 (A) e Hep3B (B) rilevate dal test di guarigione delle ferite.(C e D) L'effetto del clotrimazolo sulla migrazione e l'invasione delle linee cellulari HuH7 (C) e Hep3B (D) rilevate dal saggio transwell.I risultati della quantificazione sono espressi come media ± DS (n=3), *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo.Per esplorare ulteriormente i meccanismi mediante i quali il clotrimazolo inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule HCC, abbiamo esaminato le molecole associate all'EMT tramite l'analisi western blot.Pertanto, abbiamo osservato che il clotrimazolo ha inibito significativamente l'espressione di vimentina e N-caderina nelle cellule HCC, migliorando significativamente l'espressione di E-caderina (Figura 3A).Inoltre, nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo (HuH7 e Hep3B), l'espressione di ERK e p65 non è cambiata in modo significativo.Tuttavia, ERK fosforilato e p65 erano entrambi significativamente sottoregolati (Figura 3B).Questi risultati hanno suggerito che il clotrimazolo regola l'EMT e reprime la fosforilazione di ERK.Figura 3 Il clotrimazolo regola i percorsi EMT ed ERK.(A e B) I livelli di vimentina, N-caderina ed E-caderina nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo.(C e D) I livelli di ERK, p-ERK, p65 e p-p65 nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo.I risultati della quantificazione sono espressi come media ± DS (n=3), *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo (gruppo clotrimazolo 0μM).Figura 3 Il clotrimazolo regola i percorsi EMT ed ERK.(A e B) I livelli di vimentina, N-caderina ed E-caderina nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo.(C e D) I livelli di ERK, p-ERK, p65 e p-p65 nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo.I risultati della quantificazione sono espressi come media ± DS (n=3), *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo (gruppo clotrimazolo 0μM).Per verificare se il clotrimazolo inibisce le metastasi dell'HCC attraverso il percorso ERK, abbiamo utilizzato l'attivatore ERK honokiol.Il trattamento delle cellule HCC ferite con una combinazione di honokiol e clotrimazolo ha provocato ferite più strette rispetto alle cellule trattate solo con clotrimazolo (Figura 4A-D).Inoltre, i saggi transwell hanno rivelato che più cellule HCC hanno attraversato la membrana dopo il trattamento combinato honokiol-clotrimazolo rispetto alle osservazioni fatte dopo il trattamento con solo clotrimazolo (Figura 4E-H).Questi risultati hanno indicato che l'attivazione della via ERK può invertire parzialmente l'effetto inibitorio del clotrimazolo sulle metastasi dell'HCC.Figura 4 Clotrimazolo inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule HCC attraverso il percorso ERK.(A e B) L'effetto del clotrimazolo (20μM) da solo o combinato con honokiol (10μM) sulla migrazione delle cellule HuH7 rilevata dal test di guarigione delle ferite.(C e D) L'effetto del clotrimazolo (20μM) da solo o combinato con honokiol (10μM) sulla migrazione delle cellule Hep3B rilevata dal test di guarigione delle ferite.(E e F) L'effetto del clotrimazolo da solo o combinato con honokiol (10μM) sulla migrazione e l'invasione delle cellule HuH7 rilevate dal saggio transwell.(G e H) L'effetto del clotrimazolo da solo o combinato con honokiol (10μM) sulla migrazione e l'invasione delle cellule Hep3B rilevate dal saggio transwell.I risultati della quantificazione sono espressi come media ± DS (n=3), *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo (senza clotrimazolo e gruppo honokiol), #P<0,05 vs gruppo trattato con clotrimazolo.Figura 4 Clotrimazolo inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule HCC attraverso il percorso ERK.(A e B) L'effetto del clotrimazolo (20μM) da solo o combinato con honokiol (10μM) sulla migrazione delle cellule HuH7 rilevata dal test di guarigione delle ferite.(C e D) L'effetto del clotrimazolo (20μM) da solo o combinato con honokiol (10μM) sulla migrazione delle cellule Hep3B rilevata dal test di guarigione delle ferite.(E e F) L'effetto del clotrimazolo da solo o combinato con honokiol (10μM) sulla migrazione e l'invasione delle cellule HuH7 rilevate dal saggio transwell.(G e H) L'effetto del clotrimazolo da solo o combinato con honokiol (10μM) sulla migrazione e l'invasione delle cellule Hep3B rilevate dal saggio transwell.I risultati della quantificazione sono espressi come media ± DS (n=3), *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo (senza clotrimazolo e gruppo honokiol), #P<0,05 vs gruppo trattato con clotrimazolo.I livelli di espressione delle proteine ​​vimentina, N-caderina ed E-caderina (Figura 5A e B), nonché quelli di p-p65 e p-ERK (Figura 5C e D) sono stati significativamente sovraregolati nelle cellule HCC trattate con una combinazione di honokiol e clotrimazolo rispetto alle cellule HCC trattate con solo clotrimazolo.Tuttavia, entrambi i trattamenti non hanno alterato i livelli di espressione di p65 totale ed ERK (Figura 5C e D).Questi risultati hanno suggerito che l'honokiol inverte l'effetto del clotrimazolo sull'EMT nelle cellule HCC, indicando il suo coinvolgimento nella regolazione dell'EMT associato alle cellule HCC attraverso la regolazione del percorso ERK.Figura 5 Il clotrimazolo regola l'EMT attraverso il percorso ERK.(A e B) I livelli di vimentina, N-caderina ed E-caderina nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo (20μM) da solo o in combinazione con honokiol (10μM).(C e D) I livelli di ERK, p-ERK, p65 e p-p65 nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo da solo o in combinazione con honokiol (10μM).I risultati della quantificazione sono espressi come media ± DS (n=3), *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo (senza clotrimazolo e gruppo honokiol), #P<0,05 vs gruppo trattato con clotrimazolo.Figura 5 Il clotrimazolo regola l'EMT attraverso il percorso ERK.(A e B) I livelli di vimentina, N-caderina ed E-caderina nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo (20μM) da solo o in combinazione con honokiol (10μM).(C e D) I livelli di ERK, p-ERK, p65 e p-p65 nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo da solo o in combinazione con honokiol (10μM).I risultati della quantificazione sono espressi come media ± DS (n=3), *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo (senza clotrimazolo e gruppo honokiol), #P<0,05 vs gruppo trattato con clotrimazolo.L'HCC è una forma aggressiva di cancro altamente maligna.18 In questo studio, abbiamo studiato l'effetto del clotrimazolo sulle metastasi dell'HCC, nonché i meccanismi alla base di questi effetti.In particolare, il clotrimazolo è un agente antimicotico ad ampio spettro con forti effetti inibitori contro una varietà di funghi, in particolare C. albicans.Secondo quanto riferito, inibisce lo sviluppo del melanoma maligno e del cancro al seno attraverso i suoi impatti sulla proliferazione e metastasi del tumore, che sono mediati dall'inibizione di PI3K e glicolisi.19-22 Tuttavia, gli studi sui suoi effetti sulle metastasi dell'HCC sono limitati.Dato che è stato precedentemente riportato che il clotrimazolo sopprime l'invasione delle cellule di cancro al seno umano,8,19 in questo studio, abbiamo studiato se potesse inibire la migrazione e l'invasione delle cellule HCC.Pertanto, abbiamo osservato che inibisce la proliferazione di una varietà di linee cellulari HCC;questo è coerente con i suoi effetti inibitori sul cancro al seno umano.In particolare, inibisce preferenzialmente la proliferazione, la vitalità e la glicolisi delle cellule del cancro al seno umano.19 I nostri risultati hanno anche indicato che le cellule HCC trattate con clotrimazolo guariscono più lentamente e, in base ai saggi transwell, mostrano una ridotta migrazione cellulare, suggerendo che il clotrimazolo inibisce la metastasi e l'invasione di Cellule HCC.Invasione e metastasi, caratteristiche che sono caratteristiche dei tumori maligni, coinvolgono complessi processi multifase che sono regolati da una varietà di geni coinvolti nell'adesione delle cellule tumorali, nella degradazione stromale e nell'angiogenesi tumorale.23,24 Sebbene numerosi geni coinvolti nell'invasione del tumore e metastasi sono state identificate, i meccanismi specifici alla base della loro funzione rimangono in gran parte non caratterizzati.Inoltre, l'EMT è noto per promuovere l'invasione e la metastasi delle cellule HCC,25 e la E-caderina, un componente importante delle giunzioni di adesione intercellulare, è un marcatore importante dell'EMT.26 I nostri risultati hanno suggerito che il clotrimazolo inibisce l'espressione dei marcatori EMT, N -caderina e vimentina, mentre promuovono quella della E-caderina, suggerendo che il clotrimazolo può modulare l'invasione e la metastasi dell'HCC inibendo l'EMT.Ci sono prove che suggeriscono che la via ERK è coinvolta nell'EMT nell'HCC e, quindi, influenza anche l'invasione e la metastasi dell'HCC.27,28 Una via ERK attiva promuove l'aggressività nell'HCC;tuttavia, l'inibizione della via ERK può sopprimere l'aggressività dell'HCC.29,30 I nostri risultati hanno indicato che il clotrimazolo inibisce la fosforilazione di ERK e p65.Per confermare ulteriormente che il clotrimazolo inibisce le metastasi dell'HCC inibendo ERK, l'attivatore di ERK honokiol è stato utilizzato per attivare ERK nelle cellule HCC trattate con clotrimazolo, in cui l'attività di ERK è repressa.31 Pertanto, abbiamo osservato che l'honokiol ha invertito l'effetto inibitorio del clotrimazolo sull'HCC invasione e migrazione cellulare, suggerendo che il clotrimazolo agisca sull'HCC attraverso il percorso ERK.Diversi fattori possono essere coinvolti nella risposta dell'HCC al trattamento con clotrimazolo.I nostri risultati hanno mostrato che gli effetti del clotrimazolo su diverse linee cellulari di HCC sono alquanto diversi, suggerendo che diversi tipi di cellule di HCC rispondono in modo diverso al trattamento con clotrimazolo.In termini di applicazione clinica, sebbene il clotrimazolo sia stato utilizzato clinicamente come agente antimicotico, sono ancora necessari ulteriori studi per convalidare la possibilità della sua applicazione clinica nel trattamento dell'HCC.Inoltre, i nostri risultati hanno inizialmente confermato il ruolo di EMT ed ERK nel mediare l'inibizione della migrazione e dell'invasione dell'HCC da parte del clotrimazolo.Tuttavia, il meccanismo dell'azione diretta del clotrimazolo deve ancora essere ulteriormente esplorato.Inoltre, le mutazioni genetiche e le varianti genetiche svolgono un ruolo molto importante nello sviluppo dell'HCC.Ad esempio, il ruolo delle mutazioni in CTNNB1 e TP53 nell'HCC è stato ampiamente studiato.32-34 Se queste mutazioni svolgono un ruolo nell'applicazione del clotrimazolo nel trattamento dell'HCC richiede un'ulteriore esplorazione.Inoltre, gli esperimenti eseguiti in questo studio sono stati limitati ai test cellulari, il che implica che sono necessari ulteriori studi per determinare se il clotrimazolo ha effetti anti-HCC nell'uomo.Anche il meccanismo d'azione più diretto del clotrimazolo nell'inibire le metastasi dell'HCC deve essere supportato da ulteriori studi.In sintesi, i risultati di questo studio hanno indicato che il clotrimazolo può inibire la proliferazione, la migrazione e l'invasione dell'HCC attraverso la soppressione dell'EMT modulando la via di segnalazione ERK.Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio in cui i meccanismi alla base dell'inibizione dell'HCC mediata da clotrimazolo sono caratterizzati con un focus sul ruolo di ERK nell'EMT.Il nostro studio fornisce nuove strade per lo sviluppo di terapie per l'HCC.HCC, carcinoma epatocellulare;TACE, chemioembolizzazione arteriosa transcatetere;EMT, transizione mesenchimale epiteliale;DMSO, dimetilsolfossido;CCK-8, kit per il conteggio delle cellule-8;DMEM, Medium dell'Aquila Modificato di Dulbecco;FBS, siero bovino fetale.Questo lavoro è stato finanziato dal Piano di ricerca scientifica e tecnologica della Commissione sanitaria provinciale dell'Henan (SBGJ201802) e dal Piano di ricerca scientifica e tecnologica della provincia di Henan (LHGJ20190135).Tutti gli autori hanno dato un contributo significativo al lavoro qui riportato, nella concezione, progettazione ed esecuzione dello studio, e nell'acquisizione, analisi e interpretazione dei dati.Tutti gli autori hanno anche partecipato alla stesura, revisione o revisione critica del manoscritto;ha dato l'approvazione definitiva della versione da pubblicare;concordato sulla rivista a cui è stato presentato l'articolo;e accetta di essere responsabile di tutti gli aspetti del lavoro.Gli autori non hanno dichiarato alcun conflitto di interessi.1. 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